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1. Cómo utilizar Buffers
La Tabla 1 muestra los valores de pKa de tampones usados frecuentemente en HPLC de fase reversa. Ka representa una constante de disociación ácida y pKa es su logaritmo negativo. La capacidad del tampón se vuelve máxima cuando el pH del tampón es su pKa.
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En general, los tampones de acetato se preparan mezclando ácido acético y acetato de sodio. Sin embargo, cuando se necesita un tampón volátil (por ejemplo, para LC / MS (/ MS)), se usa acetato de amonio en lugar de acetato de sodio no volátil. Cuando se agrega un ácido o una base a un tampón, el cambio de pH se suprime mediante un desplazamiento del equilibrio (I) en la dirección de disminuir el aumento en la concentración del compuesto agregado. Esta capacidad amortiguadora es más alta cuando el pH está dentro de pKa ± 1. Por ejemplo, los tampones de acetato tienen la mayor capacidad tampón cuando el pH está entre 3,5 y 5,5 porque el pKa del ácido acético es 4,56. En la práctica, los tampones se preparan añadiendo un ácido o una base a una solución salina (concentración: unos pocos mM a unas pocas docenas de mM) de su base conjugada (por ejemplo, sal de sodio) o ácido conjugado (por ejemplo, sal de amonio).
El pKa del analito es otro factor importante. Si el pH de la fase móvil está alrededor del pKa del analito, la reproducibilidad del tiempo de retención se vuelve baja. Esto se debe a que una ligera diferencia de pH entre las preparaciones de la fase móvil cambia el grado de disociación del analito. En particular, se recomienda establecer el pH de la fase móvil menor que pKa − 2 o mayor que pKa + 2. Por ejemplo, el imidazol es un compuesto básico con un pKa de 7.01. Por lo tanto, la mayoría de las moléculas existen como iones de imidazolio cuando el pH es inferior a 5, mientras que la mayoría de ellas se encuentran en su forma no ionizada cuando el pH es superior a 9.
En general, la retención en HPLC de fase inversa se vuelve baja cuando los analitos están en sus formas iónicas. En otras palabras, si el pH de la fase móvil mantiene los analitos en su forma no ionizada, la retención se vuelve relativamente fuerte. Por ejemplo, el imidazol se retiene con más fuerza en la columna cuando el pH de la fase móvil está por encima de 9 en comparación con el pH por debajo de 5 donde se ioniza el imidazol. Las columnas resistentes a la base como InertSustain C18 permiten el análisis con estas fases móviles básicas. Los reactivos de par de iones se utilizan para retener compuestos ionizados.
Por lo tanto, el pH debe ajustarse de manera que los analitos estén ionizados. Al analizar imidazol con un reactivo de par iónico, por ejemplo, el pH por debajo de 5 se emplea típicamente para ionizar imidazol.
En modo de fase inversa
Cambiar el tipo de solvente orgánico en la fase móvil varía los tiempos de retención en muchos casos. Esto se debe a que la fuerza de elución depende del tipo de disolvente orgánico. Para mantener constantes los tiempos de retención entre diferentes disolventes orgánicos, es necesario ajustar la composición de la fase móvil. Cuando hay un cambio en el tipo de solvente orgánico, se recomienda realizar nuevamente la identificación de picos porque el orden de elución podría cambiar. En algunos casos, los picos superpuestos se separan cambiando el tipo de disolvente orgánico.
En modo HILIC
El acetonitrilo es, con mucho, el disolvente orgánico más utilizado en el modo HILIC. Cuando se cambia el disolvente orgánico de acetonitrilo a metanol, la retención se vuelve demasiado débil en la práctica. Las alternativas al acetonitrilo en modo HILIC son acetona y THF. Sin embargo, tenga en cuenta las desventajas de estos dos disolventes. La acetona no es adecuada para detectores de UV debido a su mayor absorción de UV que la del acetonitrilo. El THF causa hinchazón en PEEK, que se usa ampliamente para tubos de HPLC. Por lo tanto, asegúrese de que no haya partes humectantes hechas de PEEK en su sistema de HPLC cuando utilice THF.
En modo de fase normal
Es habitual utilizar mezclas de hexano y etanol para la fase móvil. Sin embargo, cuando la retención del compuesto objetivo es demasiado débil, la concentración de etanol debe ser extremadamente baja. En este caso, se utiliza alternativamente 2-propanol o acetato de etilo, que es un disolvente menos polar que el etanol. La fuerza de elución más débil de estos disolventes permite una mayor concentración en la fase móvil, lo que facilita la preparación de la fase móvil y mejora la reproducibilidad.
